试剂
50*TAE 存储液，PH约8.5：
242g Tris 碱
57.1ml 冰醋酸
37.2gNa2EDTA.2H2O
加H2O至1000ml
1*TAE:
200ml 50*TAE
加H2O至10000ml
乙酸钠，3mol/l 存储于4C
将40.8gNaAc.3H2O溶于水，用乙酸调至PH5.2
补加水至100ml
溴化乙锭（EB），10mg/ml
在20mlH2O中溶解0.2g溴化乙锭，均匀后于室温避光保存
1%盐酸
300ml浓盐酸，加H2O至10000ml
第一日
配胶
配置一板1%琼脂糖凝胶
超声
1、 取4-5ug DNA 入 1.5mlEpperdorf管中，共4支
2、 4管DNA分别超声4秒、8秒、14秒、20秒（其中8、14、20秒分多个相同时间段进行，间歇时间为10秒，超声时应将变幅杆居中并伸入液面3mm）
3、 各取10ul 加入2ul 6*loading buffer，上样电泳（1%琼脂糖凝胶），至溴芬蓝泳动7cm，拍照，观察超声效果，8、14秒超声管的DNA片断量应以1.6-3.0kb处最多，而超声时间4、20秒的DNA片段量应以分别在4-10kb和1-1.6kb处最多
4、 根据电泳结果，对个别超声效果欠佳的样品要再次超声，具体时间应根据实际效果而定
注：请详细填写建库组工作日程表
纯化
5、 每管加1/10体积的3MnaAc和2倍体积预冷无水乙醇，-200C 30min
6、 离心：13000rpm,10min。（室温，利于DNA沉淀），去上清
7、 各管加1ml 70% 乙醇，颠倒数次
8、 离心：13000rpm,5min
9、 弃上清，离心机甩一下，吸去上清，置室温15min以使酒精挥发干净
10、 每管加20ul无菌纯水溶解DNA，收集四管中的样品于一管
末端补平
11、 如下表所示，在DNA样品种一次添加下列各试剂
DNA 80ul
H2O 3ul
10*Buffer 10ul
dNTP(10mM) 2ul
T4Polymerase(5u/ul) 5ul
Total 100ul
充分混匀，离心机甩一下
12、 置370C水浴1小时。（50ul 30min）
13、 从水浴取出后，加50ul酚/氯仿（等体积），充分混匀至乳白色
离心：4C,13000rpm,15min
14、 吸上清至另一干净离心管中，加200ul氯仿，充分混匀至乳白色
离心：4C,13000rpm,10min（2-3分钟时停下，抽出氯仿，继续离心12min）
15、 吸上清至另一干净离心管中，加20ul 6*loading buffer，离心机中甩一下，使样品集中于管底，40C过夜
第二日
配胶
1、 配制小胶数板（每个样品一板）：1%琼脂糖凝胶.
配制大胶数半板（每个样品一半板）：1%琼脂糖凝胶.
电泳
1、 取4C保存样品上样，50ul/孔
2、 电泳60V；3hr（溴酚蓝距点样孔7cm）。
3、 分别切下1.6-2.0kb、2.0-2.5kb及2.5-3.0kb DNA 片段，反向（大片段的一边靠前）放入二次回收胶的加样孔中。（在家样孔中先加满0.5%低熔点琼脂糖凝胶）
4、 电泳150V，2hr（溴酚蓝距点样孔）。
5、 紫外灯下依次切取含DNA片段的胶，分别放入已做标记的1.5ml离心管中。
回收
6、 用QIAEXII GEL Extraction Kit 回收试剂盒从胶中回收DNA片段
1） 称取胶重，加入三倍体积buffer QXI（例如，100mg胶中加入300ul buffer QXI）
2） 50C 水浴数分钟，至胶完全融化。用手指弹 QIAEX II 使重悬，每管中加入5ul QIAEXII
3） 50C 水浴10min，每隔2min 取出颠倒混匀数次，使QIAEX II 保持悬浮
4） 4C，13000rpm，30sec。（弃上清，离心机中甩一下，吸取上清）
5） 加入500ul buffer QXI，弹管底使QIAEX II 重悬
6） 离心并去上清（同操作4）
7） 加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，去上清
8） 在加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，弃上清，离心机中甩一下，吸去上清
9） 超净台上吹干（至无酒精味），加入10ul elution buffer，重悬QIAEX II，静置5min，13000rpm，30sec。吸上清，冰浴。
7、 取1ul上清上样电泳，同时做分子量标准（1kb ladder）及DNA含量标准（20ng，40ng）对照。
8、 据电泳结果，取适量DNA进行连接
连接
9、 在一0.5ml离心管中，依次加入下列物质
Insert (DNA 样品) xul (80-100ngDNA)
H2O (7-x)ul
Ligase buffer (10*) 1ul
Vector (30ng/ul) 1ul
T4DNA ligase (3u/ul) 1ul
Total 10ul
10、 140C连接过夜（12-16小时）
纯化
将连接产物放于漂在水面上的millinpor的纯化膜上,静置1.5小时.吸出放于1.5ml的离心管中.
电转化
1. 于-70 ℃冰箱内取感受态细胞置于冰上融化，用预冷好的灭菌水轻轻注入并吹打混匀(冰上操作)，0 ℃，6000 rpm，8 min离心。
2. 吸取上清并弃之，取灭菌水补至所需体积(冰上操作)，混匀。
3. 取2 μl 纯化后得质粒，加入100感受态细胞中，混匀(冰上)。
4. 打开细胞导入仪，调至Manual，调电压为2.1KV。
5. 将加有连接产物的菌液加入到0.1cm2的电击杯中, 进行电穿孔。
6. 按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入1000μl的SOC液体培养基，转移到1.5ml的离心管中。
7．于70 rpm，37℃摇床，复苏45—60分钟，同时做阴性对照和阳性对照。
注：在此条件下，细胞的浓度较静置条件下细胞浓度高，因此，细胞分裂减少[4]。
涂板及菌液培养
1. 取30 μl菌液加入170 μl LB液体,共计200 μl涂在直径12cm的涂有X-Gal、IPTG、Amp的平板上, 37 ℃培养18小时左右。取出后，观察白/兰斑情况，并记录。
2. 取30 μl菌液加入5ml 2 x YT培养基中做液体培养，于37℃，250rpm 摇12-14个小时，观察菌液生长情况（排除噬菌体污染），并记录。
注：每块加有Amp的平板上涂有X-Gal、IPTG比例为：X-Gal为50 μl +50 μl LB液体，IPTG为12 μl涂均匀。