1、标本采取
于脐部末进行消毒处理和注射破伤风抗毒素之前，用无菌棉棒于脐部化脓部位处深处取脓汁及坏死组织，至少应同时取两份标本，一份做涂片镜检，另一份按厌氧菌要求做厌氧培养。
2、直接镜检
取上述标本直接涂片，革兰染色后镜检，观察菌体大小、形态及特征。菌体长2um-5um,宽0.4um-0.5um，两端钝圆，无荚膜。本菌为革兰阳性菌。鞭毛染色镜检，可见周身鞭毛。
3、厌氧培养
破伤风杆菌为专性厌氧菌，需在厌氧培养设备（厌氧培养箱、厌氧罐或厌氧袋）中处理标本。将标本分别接种于数管肉渣汤及牛乳培养基上，加盖凡士林，然后取其中1-2管加热80℃10min以杀死无芽孢菌。其余各管不加热，皆放在37℃孵育，观察细菌生长情况，做涂片染色镜检。
在37℃培养标本，48h后即能生成芽孢，成熟的芽孢为正圆形，未成熟的芽孢为卵圆形，芽孢较菌体直径大，芽孢位于菌体的顶端将菌体膨胀呈鼓槌状。
另将标本涂于血琼脂平皿上（培养基中加适量新霉毒素以抑制杂菌生长）行厌氧培养。如无厌氧箱等设备，可用带有异丁烯橡胶塞子和含有氧化还原指示剂的无菌试管送检。如是棉签采集的标本应直接放入含有还原剂的简易培养基中或硫乙醇钠培养基中。
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