肿瘤组织取材
应避免坏死区及口腔侧可能被污染的肿瘤组织,严格遵守无菌操作,用含丁胺卡那霉素或洁霉素的PBS液冲洗并浸泡20min。取材量应尽量多,一般为0.3cm×0.5cm×0.5cm,才有可能收获足量肿瘤细胞。尽量切取质地较软的组织,因为质地硬的组织生长慢,有的甚至不生长,有活性的肿瘤细胞太少。这些都会使OD值偏低,造成检测失败。
肿瘤悬液的制备
取下的肿块组织应立即制备成肿瘤细胞悬浮液,一般认为组织越新鲜,培养成功的可能性越大。消化时间应尽量缩短。消化用的酶类有两类,一是特异性酶,包括胶原酶、透明质酸酶,它们的作用点是癌组织的间质细胞;二是非特异性酶,如胰蛋白酶等,我们发现胰蛋白酶对瘤细胞的损害大于用胶原酶及透明质酸酶所造成的损伤。
肿瘤细胞的培养
96孔板细胞培养为开放式,除了注意CO2浓度、温度外,还应保持培养箱的湿度。在初始的4例实验中,发现96孔板周边的培养孔测出的OD值明显偏大,其中两面都处于边界的4个角处的培养孔OD值离均趋势更明显。由于周边培养孔蒸发较严重,影响了检测结果。为此留出四周的培养孔,在其中加入适量无菌生理盐水,上述现象得以消除
MTT的温育时间
加入MTT试剂后2～4h的温育时间能使MTT反应完全,生成甲瓒。本实验证实在MTT法检测肿瘤细胞株或活性正常的细胞时2～4h确能使MTT反应完全生成甲瓒,但发现部分标本的肿瘤原代培养细胞加MTT温育4h后显微镜下却仍未见甲瓒晶体形成,得适当延长温育时间(如隔夜)才出现甲瓒晶体。
肿瘤细胞的纯化
肿瘤组织内存在肿瘤细胞和非肿瘤细胞,这些细胞均含有可还原MTT的脱氢酶,故常常影响实验数据。Yamaue等采用梯度离心法去除非肿瘤细胞,纯化肿瘤组织细胞悬浮液,使肿瘤细胞高达90%以上,但这要求有较大量的活肿瘤细胞。