痰涂片检查法
一、直接涂片法
1、玻片的准备：取经
95％乙醇擦拭脱脂过的干燥、清洁、无油污、无划痕的新玻璃片，在玻片左端1/3处注明实验室序号及标本序号
(如使用的载玻片一端无磨砂面，应该用玻璃笔编号；如使用的载玻片一端有磨砂面，可用
2B铅笔在磨砂面上直接书写)。
2、痰标本：小心打开承载痰标本的容器，用折断的竹签茬端挑取标本的脓样、干酪样或可疑部分约0.05mL-0.1mL，于玻片正面的右侧2/3中央处均匀涂抹成10mm×20mm的卵圆形痰膜，待自然干燥后，染色镜检。
二、集菌痰涂片法
1、漂浮集菌法：痰标本经121℃高压灭菌15min，待冷却后，取5mL-10mL痰液至体积为100mL的玻璃容器中(口径约2cm)，加灭菌蒸馏水20mL-30mL，总体积勿超过容器的1/3，加二甲苯0.3mL，放于振荡器中振荡10min，加蒸馏水至满瓶口，将已编号的载玻片盖于瓶口上，静置20min，取下载玻片，自然干燥，火焰固定，染色镜检。
2、离心集菌法：痰标本经121℃高压灭菌15min，待冷后取5mL～10mL盛于体积为50mL的离心管中，加水至50mL，经3 000×g离心20min后，取沉淀涂片检查。
3、染色方法
萋尔一尼尔逊氏(Ziehl一。Neelsen)抗酸染色法，简称萋一尼氏染色法。
染色剂配制
石炭酸复红染色剂：碱性复红乙醇储存液(碱性复红89，溶于95％乙醇100mL中)10ml,，加
5％石炭酸水溶液至100mL，混匀。
盐酸乙醇脱色剂：浓盐酸5ml．加95％乙醇至100mL，混匀。
亚甲蓝复染剂：亚甲蓝储存液(亚甲蓝0.39加95％乙醇50mL待溶解后，加蒸馏水至100mL)
以蒸馏水5倍稀释，经充分振荡、混合均匀后，使用定性滤纸过滤。
染色步骤
涂片自然干燥后，火焰固定，平放于染色架上。
滴加复红染色剂盖满玻片，微火加热至出现蒸气后脱离火焰，保持染色5min；染色期间应始终保持痰膜被染色液覆盖，必要时可续加染色液，加温时勿使染色液沸腾。
用流水自玻片背面上端轻洗，洗去染色液。
自痰膜上端外缘滴加脱色剂，流过痰膜，需脱至痰膜无可视红色为止，脱色应单片进行。
流水自玻片背面上端轻洗，洗去脱色液。
滴加亚甲蓝复染剂，染色时间30s。
流水自玻片背面上端轻洗，洗去复染液，待干后镜检。
镜检与报告：用双目光学显微镜(目镜10×，油镜100×)镜检，在淡蓝色背景下，抗酸杆菌呈红色，其他细菌和细胞呈蓝色。
按照下列标准报告镜检结果：
——抗酸杆菌阴性(一)：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌。
——报告抗酸杆菌数：1～8条／300视野。
——抗酸杆菌阳性(+)：3～9条／100视野。
——抗酸杆菌阳性(++)：1～9条／10视野。
——抗酸杆菌阳性(+++)：1～9条／每视野。
——抗酸杆菌阳性(++++)：≥10条／每视野。
阴性结果应该观察不少于300个视野，抗酸杆菌阳性(+)以上阳性结果应该观察100个视野；在痰标本检查报告中应包括痰标本的性状和质量。
质量控制要求：为保证痰涂片检查质量，应建立和健全实验室室内质量控制和室问质量评估检查制度。室内质量控制应包括痰标本收集、痰片染色和镜检结果复核等，痰涂片应保存供上级结核病实验室(或质量控制机构)质量控制复验。
4、荧光染色法(金胺O法)
荧光染色试剂的配制
金胺O染色液：金胺“O”19溶于95％乙醇100mL内，加5％石炭酸至1 OOOmL，混匀。
盐酸乙醇脱色液：35％浓盐酸5mL95％乙醇至100mL，混匀。
高锰酸钾复染液 0.59高锰酸钾加蒸馏水至100mL，混匀。
染色步骤
涂片自然干燥，经火焰固定后，平放于染色架上。
加染色剂盖满玻片，染色30min，水洗。
加脱色剂盖满玻片，脱色3min，至无黄色，水洗。
加复染剂盖满玻片，复染2min，水洗，干后镜检。
镜检与报告：玻片放置在载玻台上并以卡尺固定后，首先以目镜(10×)、物镜(20×)进行观察，发现疑似抗酸菌的杆状荧光颗粒时，用物镜(40×)确认菌体形态；在暗色背景下，抗酸杆菌呈黄绿色或橙色荧光；荧光染色后涂片应在24h内检查，遇需隔夜时，置4℃保存，次日完成镜检。按下列标准报告荧光染色检查结果：
——荧光染色抗酸杆菌阴性(一)：镜检50个视野内未发现抗酸杆菌者。
——荧光染色抗酸杆菌阳性(报告抗酸菌数)：1～9条／50视野。
——荧光染色抗酸杆菌(+):10～99条．／50视野。
——荧光染色抗酸杆菌(++)：1～9条／每视野。
——荧光染色抗酸杆菌(+++)：10～99条／每视野。
——荧光染色抗酸杆菌(++++)：≥100条／每视野。